Padronização de técnicas por citometria de fluxo, paraavaliar viabilidade e aspectos da interação entre C. pseudotuberculosis e células fagocitárias murinas

Abstract

Introdução: Com o avanço no entendimento de bioprocessos, houve um significativo aumento de novas técnicas que geram diversas informações sobre as interações celulares. Dentre estas técnicas, a citometria de fluxo têm se consolidado como uma importante ferramenta com amplas aplicações, como por exemplo contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo, com a análise de vários parâmetros simultaneamente. Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa principalmente em caprinos e ovinos, doença que deprecia o valor do couro e carne no mercado agro-industrial. Objetivo: padronizar técnicas, através da citometria de fluxo, para avaliar a contagem absoluta deste microrganismo, bem como aspectos fisiológicos e da interação entre C.pseudotuberculosis e células fagocitárias murinas. Metodologia: Cultivo de C.pseudotuberculosis em meio BHI - T80 0,5%, seguido da marcação deste microrganismo com corantes fluorescentes, em diferentes períodos que definem diferentes estados fisiológicos ao longo do seu crescimento. Ensaio de fagocitose utilizando células do peritônio de murinos de duas linhagens após peritonite induzida por Tioglicolato de Sódio, cultivadas e lavadas para aderência celular. Após a adesão celular, foi feito o desafio com bactérias coradas com regente fluorescente, com 1h 30 min de infecção as células aderentes foram tripsinizadas, posteriormente lavadas e centrifugadas para o ensaio por citometria de fluxo. Resultados: Observou-se um período de crescimento similar a uma curva padrão de crescimento microbiano (fases lag, log, estacionária e de declínio), contudo a técnica utilizada permitiu a distinção entres diferentes estados fisiológicos. Os dados obtidos na citometria evidenciam populações de células fagocíticas contendo bactérias no citoplasma, sendo observadas duas populações envolvidas neste processo. Uma população de baixa complexidade interna, similar à apresentada por linfócitos, e uma população com complexidade interna moderada similar a apresentada por células de origem monocítica. As células dos camundongos CBA participando da fagocitose de microrganismos da linhagem T1 apresentam uma maior granulação interna que aquelas encontradas no peritônio dos camundongos da linhagem suíça nas mesmas condições, sugerindo uma maior ativação celular. O mesmo fenômeno pode ser observado quando as células participam da fagocitose da linhagem C57. Células peritoneais de camundongos CBA apresentaram maior capacidade de fagocitose e nesta linhagem se observou um maior envolvimento de células mononucleares fagocíticas nesta atividade. Para a linhagem suíça, observou-se uma maior participação de células compatíveis com linfócitos na fagocitose deste microrganismo. Conclusões: A técnica de citometria de fluxo com a marcação por florescência foi eficaz para a avaliação do crescimento e viabilidade de Corynebacterium pseudotuberculosis, bem como da interação das células bacterianas com as células fagocitárias peritoneais murinas. A CF constitui-se, portanto, numa técnica eficiente para a avaliação da curva de crescimento desta bactéria, permitindo a distinção dos diferentes estados fisiológicos, inclusive podendo indicar um mecanismo de escape à fagocitose.